Entendendo a modificação genética com CRISPR

Todas as células possuem DNA, sejam as células do nosso corpo, as células de plantas ou as de bactérias. Cada célula guarda informações hereditárias sobre como elas devem funcionar, o que devem produzir, e como devem se organizar. O conjunto dessas informações, cada uma escrita em genes, forma o genoma. A biotecnologia permitiu estudar de forma mais profunda esse genoma, sequenciando-o a fim de conhecer a ordem em que cada nucleotídeo (adenina, guanina, citosina e timina) aparecia ao longo da fita de DNA. Essa informação permite que agora modifiquemos os genomas de diversos organismos para obtermos produtos biológicos em prol da saúde e bem-estar humano.

Um exemplo clássico de modificação genética feita pela biotecnologia foi a produção da insulina transgênica em bactérias, para posterior comercialização para diabéticos. Essa modificação consistia em pegar a fita de DNA do organismo aceptor, no caso a bactéria, e cortá-la utilizando tesouras moleculares denominadas de enzimas de restrição. O DNA do doador, o gene para a produção de insulina da espécie humana, era então inserido na bactéria através da formação de pequenos poros em sua membrana induzidos artificialmente, e colado ao DNA aceptor através da ligase, uma enzima que atua como uma cola molecular.

Hoje é possível fazer modificações genéticas de outro modo, utilizando-se um sistema denominado CRISPR. Esse sistema foi descoberto em bactérias, e acredita-se que ele atue como um sistema de defesa nesses organismos contra genomas invasores, como os virais. Esse sistema é formado por três componentes principais: a molécula de CRISPR propriamente dito, que pode guardar em si uma molécula de DNA que serve de guia para identificar DNA invasor (ou o DNA que se pretende modificar); uma enzima denominada Cas, que é capaz de cortar o DNA com alta precisão; e o DNA de interesse.

A molécula de CRISPR guia o sistema, uma vez que ela contém a molécula de DNA dentro dela que direciona qual sequência procurar no núcleo celular. Uma vez encontrada a sequência, forma-se um complexo que deve ser capaz de ativar a nuclear Cas para que haja então a clivagem do DNA. Com esse sistema é possível trocar um DNA defeituoso por uma cópia normal desse gene, permitindo uma manipulação genética mais eficiente do que a descrita anteriormente, a técnica do DNA recombinante. Isso ocorre porque o CRISPR é um mecanismo muito mais preciso, uma vez que ele possui uma sequência guia. Desse modo, essa técnica tem recebido bastante atenção da mídia como um sistema promissor para a terapia gênica, edição de embriões e melhoramento genético.

Palloma Porto Almeida- graduanda em Biotecnologia pela Universidade Federal da Bahia

Como fragmentos de DNA podem servir como marcador molecular?

O RFLP (Polimorfismo no Comprimento de Fragmentos de Restrição) é uma técnica da biologia molecular que analisa pedaços de DNA que foram cortados por enzimas de restrição (esses pedaços são chamados de fragmentos de restrição). O funcionamento é bem simples: existem enzimas que conseguem cortar o DNA em algumas regiões. Essas enzimas são chamadas de enzimas de restrição e apresentam vá- rios tipos, que cortam apenas sequências reconhecidas por elas. Porém, o que fica entre essas regiões pode variar de tamanho. A primeira vez que pesquisadores sugeriram essa técnica foi em 1974 e em pouco tempo ela se tornou uma ferramenta eficaz para inúmeros procedimentos de biologia molecular e biotecnologia. Quatro anos depois da descoberta dessa técnica, os pesquisadores responsáveis (Arber, Nathans e Smith) receberam o prêmio Nobel em Medicina ou Fisiologia.

Para entendermos o funcionamento dessa técnica devemos entender o que é um marcador molecular: uma região do DNA será um marcador molecular quando ela apresentar características específicas para um grupo de análise (seja esse grupo uma espécie, uma família…). Assim, o RFLP será um marcador quando apresentar variabilidade suficiente que permita análises individuais ou populacionais.

Ok, mas como verificar o tamanho desse fragmento de DNA? Bom, a resposta é simples. Existe uma técnica chamada Eletroforese em gel, que consiste na migração de uma molécula em um gel a partir da diferença de potencial elétrico. Para que isso ocorra é preparado um gel com agarose (polissacarídeo gelatinoso encontrado em algas) que prenderá as moléculas durante a migração. Após isso, é colocado o DNA em poços (pequenas cavidades no gel) e é aplicada uma corrente elétrica.

O DNA tem carga negativa, então ele será atraído pelo polo positivo. Entretanto, para chegar a esse polo, a molécula deve migrar através do gel. Os fragmentos de DNA menores irão migrar mais rapidamente do que os fragmentos maiores. Após terminar o tempo de “corrida”, é aplicada uma luz ultravioleta (UV) nesse gel, visto que antes da aplicação o DNA é tratado com uma molécula que “brilha” quando exposta a essa luz UV. Quando aplicada a luz, vê-se no gel algumas faixas de luz brilhantes, que correspondem ao DNA.

Mas como saber qual o tamanho exato desse DNA para que se possa prosseguir na análise? Para isso, utiliza-se um Ladder, que nada mais é do que uma sequência de DNA de tamanho conhecido, que aparecerá no gel. Assim, é possível comparar a amostra que o pesquisador desconhece com a conhecida, descobrindo assim o tamanho da amostra. Esse ladder é medido em pares de base, ou seja, quantas bases nitrogenadas (componentes do DNA) tem naquele fragmento.

Para facilitar ainda mais a visualização das bandas, faz-se uma técnica chamada de Southern Blot, que consiste em transferir o DNA do gel da eletroforese para uma membrana de nylon ou nitrocelulose. Cada indivíduo ou grupo apresentará um padrão de fragmentos (bandas), que é chamado de perfil de digestão, que é detectado pelo número e tamanho dos fragmentos gerados. Assim, essa técnica pode servir para identificar genótipos heterozigotos, visto que é um marcador codominante; para mapear o genoma de um grupo; para teste de paternidade; para detecção de doenças hereditárias e muitas outras aplicações.

Com isso, vemos que o RFLP é um bom marcador molecular, por apresentar diversidade em aplicações e ser um marcador codominante, ou seja, onde é possível se diferenciar homozigotos de heterozigotos. Este marcador pode apontar relações de cruzamento entre casais, determinar relações de parentesco e até auxiliar na genética forense para resolução de crimes. Porém, entre as desvantagens dessa metodologia podemos citar o fato desta ser cara para execução (demanda de aparelhos e reagentes caros), utilizar sondas que são tóxicas (necessitam de cuidado no manuseio) e é relativamente trabalhoso.

Texto por: Francisco Sassi

Volume 2, Número 4

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